Baldanta S, Guevara G, Navarro-Llorens JM

SEVA-Cpf1, a CRISPR-Cas12a vector for genome editing in cyanobacteria

Microb Cell Fact. 2022 May 28;21(1):103

DOI: 10.1186/s12934-022-01830-4

RESUMEN

Introducción: Las cianobacterias son autótrofos fotosintéticos con alta plasticidad metabólica y capacidad para crecer utilizando CO2 y luz solar, lo que hace que tengan un tremendo potencial en aplicaciones industriales. La tecnología CRISPR se ha utilizado en la edición genética de cianobacterias en procesos de ingeniería metabólica. A pesar de los avances significativos en la edición del genoma en varias cepas de cianobacterias, la falta de herramientas genéticas adecuadas sigue siendo un factor limitante en comparación con otras especies de laboratorio modelo. Entre las limitaciones, una de las principales es contar con un banco plásmidos versátiles que puedan facilitar el uso de la tecnología CRISPR. Resultados: En este estudio se desarrollaron varios vectores CRISPR-Cpf1 basados en los plásmidos SEVA (Figura 1). La colección SEVA son vectores con elementos modulares que se pueden intercambiar y modificar llamados cargos (p. ej. Origen de replicación, resistencia, etc.). Como primer paso se probaron plásmidos con un origen de replicación RSF1010, de amplio espectro. Estos plásmidos fueron capaces de transformar no solo cianobacterias modelo si no también una cianobacteria extremófila, Chroococcidiopsis sp. Una vez verificada la capacidad de transformación, se construyeron vectores SEVA con los elementos del sistema CRISPR-Cpf1 y se demostró que la capacidad de transformación se mantenía en todas las cepas de cianobacterias probadas, también se pudo transformar naturalmente Synechosystis sp. Finalmente, como prueba de concepto se procedió a la deleción sin marca del gen nblA en Synechocystis sp. PCC 6803, demostrando que los plásmidos SEVA basados en la tecnología CRISPR-Cpf1 construidos en este trabajo se pueden usar para la modificación genética de cianobacterias. Conclusiones: En este estudio se han desarrollados vectores de edición genética mediante el sistema CRISPR-Cpf1 basados en los plásmidos SEVA. De acuerdo a los resultados obtenidos estos vectores son de fácil manipulación en el laboratorio, capaces de transformar por conjugación o naturalmente diferentes especies de cianobacterias, además de presentar una tasa alta de eliminación del plásmido para futuras ediciones. Todo esto hace que los plásmidos obtenidos sean una herramienta de gran utilidad con una amplia gama de aplicaciones que pueden ir desde la ingeniería metabólica y estudios de ciencia básica.